CITOMETRIA DE FLUJO – Bygens

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Citometría de Flujo

La citometría de flujo (CMF) es una técnica avanzada, automatizada, objetiva y altamente sensible utilizada para el análisis del inmunofenotipo de células normales y anormales. Permite realizar análisis multiparamétricos célula a célula, identificando la expresión de proteínas celulares. Aunque pierde información sobre la localización tisular en tejidos disgregados, se recomienda su uso junto con técnicas de inmunohistoquímica.

La CMF emplea anticuerpos monoclonales unidos a fluorocromos y un sistema informático para analizar un elevado número de partículas en suspensión en poco tiempo, permitiendo la identificación de múltiples parámetros celulares y la detección de células tumorales con una sensibilidad superior a 1 x 10-4. Sin embargo, presenta limitaciones en la diferenciación de células normales y leucémicas en muestras con un bajo número de células y requiere el uso de una suspensión celular.

Como funciona

Un rayo de luz monocromática, típicamente generado por un láser, se enfoca hidrodinámicamente en un fino chorro de líquido. Se disponen detectores en el punto donde el chorro de líquido atraviesa el rayo de luz: uno alineado con el rayo (conocido como FSC, por su sigla en inglés, Forward Scatter o dispersión frontal), y varios dispuestos angularmente respecto a la trayectoria del rayo (llamados SSC, por Side Scatter o dispersión lateral), además de uno o más detectores de fluorescencia. Cada partícula suspendida, con un tamaño de entre 0,15 y 0,20 micrómetros, dispersa el rayo de luz, y las sustancias fluorescentes presentes en o sobre las partículas son excitadas, emitiendo luz a una longitud de onda mayor que la de la fuente de luz. La combinación de luz dispersada y fluorescencia es captada por los detectores, permitiendo derivar diversos tipos de información sobre la estructura física y química de cada partícula individual.

El detector frontal (FSC) proporciona datos sobre el tamaño de la partícula, mientras que los detectores laterales (SSC) ofrecen información sobre su complejidad interna, como la morfología del núcleo celular, la cantidad y tipo de gránulos citoplasmáticos o la textura de la membrana plasmática, debido a que los componentes internos de las células dispersan la luz. Algunos citómetros de flujo en el mercado han prescindido de la necesidad de un detector de fluorescencia, utilizando únicamente la información de luz dispersada para las mediciones. Otros son capaces de generar gráficos que combinan datos de fluorescencia celular, dispersión de luz y transmisión de luz.

Analisis de datos

Los datos generados por los citómetros de flujo pueden ser dibujados en relación con una variable, en forma de histograma, o en gráficos de puntos (dot-plot) de dos dimensiones y dos o más variables, o incluso en gráficos tridimensionales. Las regiones delimitadas en estos gráficos pueden ser separadas secuencialmente, de acuerdo con la intensidad de la fluorescencia, para crear una serie de subgrupos llamados «gates» (portales). Existen protocolos específicos para hacer la separación en gates, proceso conocido como gating, tanto para propósitos clínicos como diagnósticos.

Los gráficos de citometría con frecuencia se hacen en función de escalas logarítmicas. Ya que los diferentes compuestos fluorescentes utilizados para hacer el marcado poseen espectros de emisión que con frecuencia se solapan, las señales recogidas por los detectores deben ser compensadas tanto electrónica como computacionalmente. Los datos acumulados por los citómetros pueden ser analizados utilizando diferentes softwares, tales como por ejemplo WinMDI6 (el único que es freeware), Flowjo, FCS Express, VenturiOne, CellQuest Pro, o Cytospec.7 Una vez que se han recogido los datos, no se hace necesario que la computadora siga conectada al citómetro, razón por la cual la mayor parte de las veces el análisis de datos se hace en otro ordenador. Esto se hace especialmente necesario en instalaciones centrales donde la utilización de estas máquinas se encuentra bajo alta demanda.

Clasificación de células activadas por fluorescencia

La técnica de clasificación de células activadas por fluorescencia FACS por sus siglas en inglés (Fluorescence-Activated Cell Sorting) es un tipo especializado de citometría de flujo. Esta técnica provee un método para la clasificación y selección de células provenientes de una mezcla de varias poblaciones en dos o más contenedores de a una célula por vez, según las características particulares de dispersión y fluorescencia de cada célula. Es un instrumento científico de gran utilidad ya que provee un método de grabación de datos provenientes de las señales de fluorescencia de cada célula que es a la vez rápido, objetivo y cuantitativo; además permite la separación física de aquellas células pertenecientes a una población de interés.

La suspensión de células es arrastrada hacia el centro de una corriente de líquido estrecha, que fluye rápidamente. El flujo está dispuesto de manera que existe una gran separación entre células en relación con su diámetro. Un mecanismo de vibración ultrasónico provoca que la corriente de líquido conteniendo las células se rompa en pequeñas gotitas. El sistema se ajusta de modo que haya una baja probabilidad de que más de una célula quede contenida en cada gota. Justo antes de que la corriente se rompa en gotitas, el flujo pasa a través de una estación de medición de fluorescencia, donde se mide el carácter fluorescente de interés de cada célula. Un anillo capaz de adquirir una carga eléctrica se coloca justo en el punto donde la corriente se rompe en gotitas. Según la medición de la intensidad de fluorescencia recogida para cada célula, el sistema entrega una determinada carga eléctrica al anillo, como consecuencia las gotitas se cargan eléctricamente con un signo contrario al del anillo mientras se desprenden de la corriente de líquido. Las gotitas cargadas luego caen a través de un sistema de deflexión electrostática que desvía las gotas en los contenedores dependiendo de su carga. En algunos sistemas, la carga se aplica directamente a la corriente de líquido, y como resultado la gotita que se desprende retiene carga del mismo signo que la aplicada. Luego de que la gotita se desprende, el anillo recupera una carga neutra.

Marcadores

En citometría de flujo, se pueden emplear una amplia variedad de fluoróforos como etiquetas para el marcado fluorescente. Estos fluoróforos suelen estar químicamente unidos a anticuerpos específicos capaces de reconocer una molécula diana en la superficie o el interior de la célula. También es posible unir químicamente estas etiquetas fluorescentes a casi cualquier compuesto químico con cierta afinidad por la membrana celular u otras estructuras celulares. Cada fluoróforo presenta un pico de excitación y una longitud de onda de emisión características. Sin embargo, los espectros de emisión de diferentes etiquetas suelen superponerse, lo que limita la combinación de marcadores que pueden utilizarse y depende de la longitud de onda de la lámpara(s) o el láser(es) utilizados para excitar los fluorocromos, así como de los tipos de detectores disponibles.

Se estima que el número máximo de marcadores fluorescentes distinguibles se encuentra entre 17 o 18, lo cual requiere un proceso de optimización meticuloso para limitar los artefactos y algoritmos complejos de deconvolución para separar los espectros superpuestos.

Existen marcadores fluorescentes de unión covalente, como el isotiocianato de fluoresceína, la picoeritrina, la rodamina, el rojo texas y las cianinas. También hay marcadores fluorescentes de unión no covalente, como el Hoechst, el DAPI, la naranja de acridina, el yoduro de propidio y el rh12. Es importante tener en cuenta que los marcadores fluorescentes son sensibles al entorno en el que se encuentran.

Características

Todas nuestras pruebas están realizadas por laboratorios acreditados con las más altas certificaciones de calidad como:

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